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技術支持

醫用真空冷凍干燥機：血小板凍干再水化的條件及其凝血功能變化

血小板(plaet)是由骨髓巨核細胞產生并釋放于血液循環中的zui小細胞,在止血和凝血過程中發揮著重要的作用。由于血小板保質期較短，臨床輸注需求量大，加之臨床輸注需求時間的不確定性，造成了血小板過期浪費和臨床供不應求的兩難尷尬局面。目前國內血小板主要保存方式是22℃振蕩保存，有效期為 5d。此外血小板還可深低溫冰凍保存，但這種方法的保存效果和臨床療效不確切。冷凍干燥技術已廣泛應用于各種生物材料的保存，凍干制品具有常溫下保存、性能穩定、便于運輸的特點。本研究以過期血小板為原料，探索血小板凍干再水化的條件，檢測其凍干再水化后凝血功能的變化，為過期血小板再利用及新鮮血小板冰凍或低溫保存研究提供了依據。

1、材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 血小板來源實驗組選擇體檢合格，一周內未服用阿司匹林等抗血小板**的自愿獻血者，用血細胞分離機單采富含血小板血漿，22℃振蕩保存 5d 過期；對照組選擇新鮮機采血小板。

1.1.2 主要試劑和溶液海藻糖 (CH22O11·2H2O，北京經科宏達生物技術有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，上海生工生物工程有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)；血小板聚集誘導劑二磷酸腺苷(ADP，Sigma公司)；凝血酶(Sigma 公司)；膠原(Sigma 公司)；瑞斯托霉素(Sigma 公司)；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS 公司 )；海藻糖加載緩沖液 ( 含50mmol/L 海藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 為 6.8)；凍干保護劑(含 20%海藻糖，1% 牛血清白蛋白，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2)；復水溶液為 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 比例混合制成。以上試劑和溶液均在有效期內。

1.2 主要儀器

醫用真空冷凍干燥機、恒溫振蕩水浴、流式細胞儀、血球計數儀、血小板聚集儀

1.3 實驗方法

1.3.1 血小板的凍干保存血小板濃縮液離心洗滌后重懸于海藻糖加載緩沖液中，將上述懸浮液轉移進入離心管中，并用聚四氟乙稀生料帶密封，于37℃水浴中振蕩孵化 4h。將孵化后的血小板懸浮液 800g 離心 3min。去除上層孵化液，得到沉淀的血小板塊，加入凍干保護液打散重懸，使用血球計數儀進行計數，調節血小板在凍干保護液中的濃度為 1×109個/ml。將制備好的血小板凍干懸浮液裝入特制凍干血盒中，密封充注口。將血小板凍干懸液先以 20℃/min 的速率凍結至-40℃，預凍 2h后，再以 1.5℃/min 對擱板升溫至-30℃，退火 0.5h，然后進入一次干燥，-38℃維持一次干燥條件 20h，zui后以 0.2℃/min 的加熱速率使隔板溫度升高至20℃，維持二次干燥條件 10h 直至凍干結束。凍干的血小板密封保存在室溫。

1.3.2 凍干血小板的水化將 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 的比例混合制成血小板凍干復水液，將1ml 復水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中，輕輕震蕩直到樣品完全溶解于復水溶液中。

1.3.3 檢測血小板回收率用血球計數儀分別對凍干前和凍干再水化后的血小板計數，計算凍干再水化血小板回收率。凍干再水化血小板回收率(%)=凍干再水化后血小板計數/凍干前血小板計數×100%。

1.3.4 檢測血小板穩定性凍干再水化血小板分別在室溫放置 0h、2h、4h、6h、8h 后，用血球計數儀測定血小板回收率。

1.3.5 血小板形態及超微結構觀察用掃描電鏡觀察血小板的形態；分別以戊二醛固定、脫水、環氧樹脂包埋后制作超薄切片，用透射電鏡觀察血小板超微結構變化。

1.3.6 血小板聚集反應檢測將凍干血小板復水后轉入離心管中進行洗滌以去除細胞外保護劑，再用新鮮冰凍血漿重懸血小板，調整血小板濃度為(0.2~0.3)×1012/L。用 APACT-2 型血小板聚集儀檢測凍干再水化后血小板對四種同濃度誘導劑—凝血酶、膠原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集反應。

1.3.7 血小板表面糖蛋白檢測用三色流式細胞儀分別檢測凍干再水化血小板表面激活指標 CD62p和 PAC-1 的表達，經凝血酶激活后測定 CD62p 和PAC-1 的再表達。再表達率=凝血酶處理后表達率-血小板表達率1.3.8 統計分析數據以均數±標準差(x±s)表示，采用 SPSS16.0 統計軟件進行數據分析處理，組間差異比較用 t 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2、結果

2.1 血小板回收率及穩定性實驗組和對照組間血小板計數有統計學意義(P<0.05)，凍干再水化血小板回收率為 49.36%
文章鏈接：制藥網 https://www.zyzhan.com/tech_news/detail/63342.html

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